检测饮用水中肠球菌的方法

水中的肠球菌也被称为革兰阳性球菌，此类菌种广泛的分布于自然环境及人、动物等消化道内。因此在常见的地表水也有此类菌种的存在，目前针对肠球菌的检测可以采用很多方法，例如常用的平板计数法、最近似值测定法以及酶底物法。而今天我们要了解的就是利用酶底物法检测饮用水中肠球菌的具体步骤。

  其原理是肠球菌在41℃温度条件下培养24h，能够产生β-D-葡糖苷酶，将选择性培养基中荧光底物4-甲基伞形酮β-D-葡糖苷（4-MUG）分解，分解后的荧光底物在366nm紫外光下产生荧光，统计阳性反应数量，通过查询MPN表，计算样品中的肠球菌浓度。

饮用水水样采集

检测试剂及材料

1.市售Enterolert 培养基，也可以使用其他等效产品。

2. 生理盐水:氯化钠浓度为0.85%。

3.标准菌株:粪肠球菌有证标准菌株，大厂埃希氏菌有证标准菌株。

4.无菌水:实验室一级纯水，经121℃高压蒸气灭菌20min。

5.硫代硫酸钠:纯度≥98%。

6.硫代硫酸钠溶液(5.0g/L)

称取0.5g硫代硫酸钠，精确至0.1g，溶于适量水中，定容至100mL，121℃高压灭菌20min。

7.磷酸盐缓冲液:

氯化钠                8.01g

氯化钾                0.2g

磷酸氢二钠            1.44g

磷酸二氢钾            0.24g

上述成分溶解于950mL无菌水中，用盐酸调节溶液pH值到7.4后加无菌水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min，备用。

检测仪器

1.采样瓶:具螺旋盖或磨口塞的100mL、500mL玻璃瓶。

2.恒温培养箱:允许温度偏差41℃±1℃。

3.高压蒸汽灭菌器:121℃可调。

4.程控定量封口机:用于定量盘的封口。

5.紫外灯及配套灯箱:366nm。

6.定量盘:51孔或97孔。

7.天平:精确至0.001g。

8.容量瓶:10mL和100mL。

检测步骤

首先是定性分析

  用灭菌处理过的100mL采样瓶量取100mL水样，加入一包培养基，混摇均匀使之完全溶解，放入恒温培养箱中41℃±1℃培养24h。

其次是定量分析

  用灭菌处理过的100mL采样瓶量取100mL水样，加入一包培养基，混摇均匀使之完全溶解。

  将上述100mL水样全部倒入51孔无菌定量盘内，抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后用程控定量封口机封口，放入恒温培养箱中41℃±1℃培养24h。

  空白对照可以用无菌水按照检测步骤进行操作。

定性结果

  定性分析的水样，在紫外灯下观察，产生荧光，则判定为阳性反应；不产生荧光则判定为阴性反应。

定量结果

  在紫外灯下观察培养24h定量盘，计数有荧光反应的孔数，参照可信范围表计数定量，结果以MPN/100mL表示。如所有孔穴均未产生荧光，则报告肠球菌“未检出”。若荧光不明显，可以延长培养时间至28h进行结果判读，超过28h后出现的颜色反应，不作为阳性结果。